熒光是一種光致冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光(通常是紫外線或X射線)照射,吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài),并且立即退激發(fā)并發(fā)出出射光(通常波長比入射光的的波長長,在可見光波段);而且一旦停止入射光,發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。一般以持續(xù)發(fā)光時間來分辨熒光或磷光,持續(xù)發(fā)光時間短于10-8秒的稱為熒光,持續(xù)發(fā)光時間長于10-8秒的稱為磷光。在日常生活中,人們通常廣義地把各種微弱的光亮都稱為熒光。
生化和醫(yī)藥中熒光的應(yīng)用
熒光在生命科學(xué)領(lǐng)域領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。人們可以通過化學(xué)反應(yīng)把具有熒光性的化學(xué)基團(tuán)粘到生物大分子上,然后通過觀察示蹤基團(tuán)發(fā)出的熒光來靈敏地探測這些生物大分子。
舉例:
采用熒光標(biāo)記的鏈終止劑所得到的DNA測序圖
用于對DNA進(jìn)行自動測序的鏈末端終止法:
在原初的方法中,需要對DNA的引物端進(jìn)行熒光標(biāo)記,以便在測序凝膠板上確定DNA色帶的位置。在改進(jìn)的方法中,對作為鏈終止劑的4種雙脫氧核苷酸(ddTBP)分別進(jìn)行熒光標(biāo)記,電泳結(jié)束后不同長度的DNA分子彼此分開,經(jīng)紫外線照射,4種被標(biāo)記的雙脫氧核苷酸發(fā)出不同波長的熒光。通過熒光濾光片分析熒光的光譜便可以分辨出DNA的序列。
DNA探測:溴化乙啶(EtBr)是一種熒光染料,當(dāng)它在溶液中自由改變構(gòu)型時,只能發(fā)出很弱的熒光;當(dāng)它嵌入核酸雙鏈的堿基對之間與DNA分子結(jié)合后,便可以發(fā)出很強(qiáng)的熒光。因此在凝膠電泳中,一般加入溴化乙啶對DNA染色。
DNA微陣列(生物芯片):需要對基因組探針進(jìn)行熒光標(biāo)記,最后通過熒光濾光片分析熒光信號確定靶標(biāo)序列。
免疫學(xué)中的免疫熒光檢查法:對抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記,從而可以根據(jù)熒光的分布和形態(tài)確定抗原的部位和性質(zhì)。
流式細(xì)胞儀(又稱熒光激活細(xì)胞分選器,F(xiàn)ACS) :對樣本細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記,再用激光束激發(fā)使之產(chǎn)生特定的熒光,然后用光學(xué)系統(tǒng)檢測并將信號傳輸?shù)接嬎銠C(jī)進(jìn)行分析,從而得到細(xì)胞相應(yīng)的各種特性。
熒光技術(shù)還被應(yīng)用于探測和分析DNA及蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),尤其是比較復(fù)雜的生物大分子。
水母發(fā)光蛋白(英語:Aequorin)最早是從海洋生物維多利亞多管發(fā)光水母中分離出來的。當(dāng)它與Ca2+離子共存時,可以發(fā)出綠色的熒光。這一性質(zhì)已經(jīng)被應(yīng)用于實時觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子的流動。水母發(fā)光蛋白的發(fā)現(xiàn)推動了人們進(jìn)一步研究海洋水母并發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)。綠色熒光蛋白的多肽鏈中含有特殊的生色團(tuán)結(jié)構(gòu),無需外加輔助因子或進(jìn)行任何特殊處理,便可以在紫外線的照射下發(fā)出穩(wěn)定的綠色熒光經(jīng)過高截止的熒光濾光片過濾雜光之后可以看到清晰的信號,作為生物分子或基因探針具有很大的優(yōu)越性,所以綠色熒光蛋白及相關(guān)蛋白已經(jīng)成為生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要工具。
螢光顯微成像技術(shù):全內(nèi)反射熒光顯微鏡
很多生物分子具有內(nèi)稟的熒光性,不需要外加其他化學(xué)基團(tuán)就可以發(fā)出熒光。有時候這種內(nèi)稟的熒光性會隨著環(huán)境的改變而改變,從而可以利用這種對環(huán)境變化敏感的熒光性來探測分子的分布和性質(zhì)。例如膽紅素與血清白蛋白的一個特殊位點結(jié)合時,可以發(fā)出很強(qiáng)的熒光。又如當(dāng)血紅細(xì)胞中缺少鐵或者含有鉛時,會產(chǎn)生出鋅原卟啉而不是正常的血紅素(血紅蛋白);鋅原卟啉具有很強(qiáng)的熒光性,可以用來幫助檢測病因。